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Identificazione dell'età

Nature Communications volume

Nature Communications volume 14, numero articolo: 2836 (2023) Citare questo articolo

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Uno degli eventi chiave nell'encefalite virale è la capacità del virus di entrare nel sistema nervoso centrale (SNC). Diversi virus encefaliti, incluso il virus La Crosse (LACV), inducono principalmente encefalite nei bambini, ma non negli adulti. Questo fenomeno è stato osservato anche nei modelli murini LACV, in cui il virus ottiene l'accesso al sistema nervoso centrale degli animali svezzati attraverso la perdita vascolare dei microvasi cerebrali, probabilmente attraverso le cellule endoteliali capillari cerebrali (BCEC). Per esaminare i fattori regolatori specifici dell'età e della regione della perdita vascolare, abbiamo utilizzato la trascrittomica dell'intero genoma e lo screening mirato di siRNA per identificare i geni la cui soppressione ha influenzato la patogenesi virale nei BCEC. Ulteriori analisi di due di questi prodotti genetici, Connexin43 (Cx43/Gja1) ed EphrinA2 (Efna2), hanno mostrato un effetto sostanziale sulla patogenesi del LACV. L'induzione di Cx43 da parte dell'acido 4-fenilbutirrico (4-PBA) ha inibito la malattia neurologica nei topi svezzati, mentre la carenza di Efna2 ha aumentato la malattia nei topi adulti. Pertanto, mostriamo che Efna2 e Cx43 espressi dai BCEC sono mediatori chiave della neuroinvasione e della malattia neurologica indotta da LACV.

La Crosse Virus (LACV), un virus RNA a senso negativo appartenente alla famiglia dei bunyaviridae1, è una delle principali cause di encefalite arbovirale nei bambini2. Negli adulti, l'infezione da LACV causa generalmente una sindrome febbrile molto lieve3. La maggiore incidenza di malattie neurologiche nei bambini rispetto agli adulti suggerisce differenze legate all’età che potrebbero essere responsabili della capacità del virus di accedere al sistema nervoso centrale (SNC) e/o causare danni al suo interno. Comprendere queste differenze potrebbe fornire strade per la prevenzione o il trattamento dell’encefalite da LACV.

La barriera ematoencefalica (BBB) ​​è una barriera selettivamente permeabile che svolge un ruolo importante nell’inibire l’accesso degli agenti patogeni al sistema nervoso centrale. La barriera emato-encefalica (BBB) ​​è composta principalmente da cellule endoteliali capillari cerebrali (BCEC) con astrociti, membrana basale e periciti vicini, che interagiscono con i neuroni circostanti e la microglia per formare l'unità neurovascolare4. La permeabilità selettiva attraverso i BCEC è definita da diverse proteine ​​trasportatrici e trasportatrici insieme alle proteine ​​della giunzione stretta (TJ), della giunzione aderente (AJ) e della giunzione gap (GJ) (collettivamente proteine ​​della giunzione cellulare (CJ))5,6. L'integrità del BBB viene rafforzata durante lo sviluppo7,8. Raggiunge il suo picco nell'età adulta e poi si indebolisce gradualmente con l'età a causa della ridotta espressione della proteina CJ e del deterioramento funzionale dei trasportatori9,10.

La patologia osservata nell'encefalite LACV indica una sostanziale rottura della BEE. L'analisi immunoistochimica (IHC) delle biopsie cerebrali di pazienti affetti da LACV mostra un rivestimento mononucleare perivascolare con aggregati focali di cellule immunitarie11 e ulteriori studi hanno dimostrato lesioni vascolari indotte da encefalite da LACV12. Pertanto, l'encefalite da LACV è strettamente associata a patologie e anomalie neurovascolari.

Un'encefalite LACV e una patologia vascolare dipendenti dall'età si osservano nel modello murino C57BL/6. I topi svezzati (~ 3 settimane di età) sono altamente suscettibili all'infezione da LACV del sistema nervoso centrale e sviluppano la malattia clinica a seguito di un'infezione periferica (intraperitoneale, IP) o diretta del sistema nervoso centrale (intracerebrale, IC). Al contrario, i topi adulti di età ≥ 6 settimane sono resistenti all'infezione periferica (IP) ma sono suscettibili all'infezione diretta del sistema nervoso centrale (IC)13,14,15. Pertanto, esiste una chiara differenza legata all’età nella capacità di LACV di accedere al sistema nervoso centrale in seguito a un’infezione periferica.

Gli studi sulla suscettibilità correlata all’età mostrano un aumento delle perdite vascolari e la rottura della BBB nei topi giovani in seguito all’infezione da LACV. Sebbene i BCEC infetti da LACV non siano facilmente osservabili in vivo, la rottura della BBB è mediata dalla perdita specificatamente attraverso i microvasi/BCEC nella regione del bulbo olfattivo (OB)/nucleo olfattivo anteriore (AON), ma non quelli nella corteccia (CT ) regione16. La perdita virale generalmente raggiunge il picco 3 giorni dopo l'infezione (dpi) e l'infezione virale dei neuroni viene osservata nelle regioni associate a questa perdita vascolare. In uno studio precedente abbiamo dimostrato che una risposta età-specifica dei microvasi cerebrali/BCEC provoca effetti citopatici differenziali e suscettibilità al LACV. Inoltre, utilizzando frammenti di microvasi cerebrali isolati ex vivo e colture in vitro di BCEC primari isolati da topi svezzati e adulti, abbiamo dimostrato che i BCEC svezzati sono più inclini all'infezione da LACV, alla formazione di aggregati simili a sincizi e alla morte delle cellule circostanti17. Le risposte BCEC possono essere controllate da diversi fattori tra cui la risposta immunitaria dell'ospite, la sopravvivenza cellulare, l'espressione delle proteine ​​CJ funzionali, il mantenimento dei vasi sanguigni o le interazioni multigeniche. L'identificazione dei fattori che differiscono tra i microvasi/BCEC cerebrali dello svezzamento e dell'adulto durante l'infezione da LACV può fornire informazioni sui fattori critici nella prevenzione della neuroinvasione di LACV.

6weeks old mice that had mixed deficiency genotypes for Efna2, Efna3 and Efna5 (Efna2−/− mixed; abbreviated as Efna2−/− (m)), as detailed in Supplementary Table 3. All mice were distributed in two groups: homozygous for Efna2 deficiency with mixed +/+, +/− or −/− genotypes for Efna3 and Efna5 (Efna2−/− (m) or heterozygous for Efna2 deficiency with mixed +/+, +/− or −/− genotypes for Efna3 and Efna5 (Efna2+/− (m)) as well as wildtype mice with Efna2+/+3+/+5+/+ genotype (wildtype, abbreviated as WT). Following inoculation of 105 PFU/mouse, approximately 50% of Efna2−/− (m) mice developed neurologic disease, regardless of their Efna3 or Efna5 genotype (Supplementary Table 3). In contrast, most of the WT or Efna2+/− (m) mice (~91%) did not show any signs of neurological disease (Fig. 4b). We also observed high levels of virus in the Efna2−/− (m) mice with clinical (C) neurological disease versus non-clinical (NC) mice (Fig. 4c). Thus, Efna2 appears to have an inhibitory role in LACV pathogenesis in vivo (Fig. 4b, c)./p> 6 weeks old) WT and Efna2−/−3+/+5+/+ mice (Efna2 single knockout (KO); abbreviated as Efna2−/−(s)). As expected, the adult WT mice were not susceptible to a 105 PFU/mouse LACV dose (~96% non-neurologic). In contrast, approximately 38% of adult Efna2−/− (s) mice developed neurological disease in response to LACV infection (Fig. 5a). Furthermore, microvessel fragments isolated from Efna2−/−(s) mice had higher levels of LACV infection compared to WT at 24 and 48 hpi (Fig. 5b, d) and reduced survival at 72 and 96 hpi (Fig. 5c). We also examined vascular leakage in vivo using fluorospheres in WT and Efna2−/− (s) mice using a slightly later timepoint of 5 dpi. WT adult mice showed no vascular leakage, while Efna2−/− (s) mice had consistent detection of 1–3 fluorescent bead foci in the brain parenchyma (Fig. 5e, 5 out of 7 mice). Thus, Efna2−/− (s) mice were more susceptible to LACV-induced neurological disease, which correlated with an increase in vascular leakage in the CNS prior to disease onset. This also correlated with increased virus infection and decreased cell survival in Efna2−/− (s) BCECs compared to WT BCECs (Fig. 5b, c). Collectively, these data indicate an important role for Efna2 in BBB integrity during LACV infection./p> 6 weeks old) mice were treated with 100 ug of Poly I:C (HMW) diluted in a 0.5 mg/mL LyoVec transfection reagent solution (Invivogen) via a 100 ul retroorbital (IV) injection. LyoVec reagent was reconstituted using the provided deionized sterile water per the manufacture's recommendations and was used alone as the vehicle control. Microvessel fragments were removed from treated and vehicle animals at 3 h post injection. For comparison of OB versus CT microvessel fragment transcript expression from LACV and mock infection conditions, C57BL/6 weanling mice were infected with a 2000 PFU IP dose of LACV diluted into 200 ul of sterile, pharmaceutical grade PBS. Mock mice received an equivalent volume of uninfected Vero supernatant diluted in PBS. Microvessel fragments from OB and CT were isolated from LACV and mock infected mice at 3 dpi. RNAs were extracted from microvessel fragments as described below and purified using Agencourt RNAClean XP beads (Beckman Coulter, Brea, CA). RNA concentration was measured using RiboGreen fluorescent RNA quantification method (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). RNA purity and integrity was assessed using Nanodrop 8000 UV spectrophotometry (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA) and the Bioanalyzer RNA 6000 Pico chip assay (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), respectively. Sequencing libraries were generated from 115 ng (Adult/Weanling) or 170 ng (OB/CT) RNA using the TruSeq Stranded mRNA sample preparation kit, according to the manufacturer's recommended protocol (Illumina, Inc., San Diego, CA). Final, purified TruSeq libraries were quantified using the Kapa SYBR FAST Universal qPCR kit for Illumina sequencing (Kapa Biosystems, Wilmington, MA), diluted to 2 nM, and pooled equally. Libraries were sequenced on the HiSeq 2500 instrument using the TruSeq Rapid PE Cluster kit and Rapid 200 cycle SBS kit (Illumina, Inc., San Diego, CA)./p> 6 weeks) were inoculated IP with 105 PFU. Mock inoculated mice were inoculated with 200 ul of PBS with the appropriate amount of cell supernatant from uninfected Vero cells to match the volume for virus dilutions. The whole brains or OB-CT regions were isolated separately from LACV and mock inoculated mice at 3 dpi. Supplementary Table 4 represents abbreviation of most of the experimental groups and other nomenclatures used throughout this manuscript./p>